L’autofluorescence des levures augmente notablement lors de leur vieillissement, pour devenir maximale lorsque les cellules sont mortes. Ce phénomène peut biaiser les résultats d’analyse, s’il n’est pas différencié des autres signaux d’arrière-plan. Nous avons donc cherché à déterminer si cette fluorescence était due à un artefact d’étiquetage ou si elle reflétait la maturation naturelle des levures lors du processus de vinification. Pour cela, nous avons utilisé une technologie de cytométrie en flux avancée : la cytométrie spectrale.

Intérêt de la cytométrie spectrale dans la mesure de la fluorescence des levures

La cytométrie spectrale, technique de pointe de cytométrie en flux, est basée sur l’utilisation de détecteurs permettant de capturer l’ensemble du spectre d’émission de fluorescence. La résolution spectrale est supérieure et la sensibilité est accrue par rapport aux méthodes traditionnelles de cytométrie en flux. L’identification et la quantification des signaux fluorescents dans les cellules sont donc beaucoup plus précises.

Notre méthodologie d’analyse des signaux fluorescents des cellules

Nous avons mené plusieurs protocoles complémentaires sur une série de vins de diverses origines géographiques, à différents stades de vieillissement ou de fermentation alcoolique :

1. Analyse via la méthode Levia Test sur un cytomètre classique (Cytek® Guava® Easycyte), permettant de mesurer et évaluer l’état physiologique (activité enzymatique) des levures en fermentation.

    

2. Analyse sur un cytomètre spectrale (Cytek® Northern Lights) sans colorants fluorescents, afin d’étudier l’autofluorescence générée sous excitation laser (violette/bleue ou rouge).

    

3. Pour simuler le vieillissement du vin, des cultures de levures ont été soumises à divers stress (thermiques, chimiques, nutritionnels) et analysées selon les mêmes protocoles.

Nos observations sur les levures en fermentation alcoolique

L’analyse des signaux fluorescents des cellules par différentes techniques de cytométrie a révélé que :

• Les cellules actives sont facilement visualisées grâce au spectre de fluorescence utilisé dans le test Levia (spécifique à la FDA).

   

• L’autofluorescence est observée, par cytométrie spectrale, uniquement sur les levures ayant évolué dans la matrice vinique (principalement dans les canaux rouges et quel que soit le laser d’excitation).

   

• Les cellules cultivées en milieu de culture (soumises à divers stress), ne présentent pas la même autofluorescence en cytométrie spectrale, y compris après transfert dans le vin.

   

• La signature de fluorescence est observée sur toutes les levures dans la matrice vinique, mais elle est plus marquée dans les vins rouges que dans les blancs.

La cytométrie spectrale permet d’évaluer finement la viabilité et le stress des levures lors de la vinification

Les résultats de notre étude mettent en évidence l’intérêt de la cytométrie spectrale, pour l’analyse précise des signaux fluorescents des cellules. En exploitant l’ensemble du spectre d’émission, cette technologie caractérise les levures par leur signature de fluorescence dont l’intensité reflète l’activité enzymatique des cellules. Elle surpasse les méthodes classiques en termes de résolution et de sensibilité, révélant l’état de viabilité et de stress des cellules.

Validation des choix technologiques d’Amarok Biotechnologies pour le suivi de la fermentation alcoolique

Amarok Biotechnologies a développé une stratégie de contrôle des fermentations alcooliques basée sur la cytométrie en flux, depuis 2015. Cette longue expérience nous permet de conclure que chaque matrice possède des caractéristiques spécifiques. 

Grâce à l’utilisation de la cytométrie spectrale, nous validons notre stratégie technique pour la distinction des cellules vivantes, endommagées ou mortes, indispensable au suivi de la vinification : 

1. Abandon de l’utilisation des fluorochromes rouges en cytométrie classique

    

2. Utilisation d’une signature de mortalité des cellules (en association avec la fluorescence verte générée par la dégradation du diacétate de fluorescéine)

Perspectives techniques pour le contrôle des fermentations du vin

L’identification de la nature des molécules fluorescentes et de leurs précurseurs permettrait de mieux comprendre les processus de la fermentation alcoolique. D’autant que nous supposons la concomitance de différents stress des levures dans la matrice complexe du vin lors du processus de production. Des études complémentaires seraient utiles pour approfondir la compréhension de ces mécanismes et optimiser le contrôle des fermentations alcooliques.